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Multi-Omics-Modellen identifiziert Achsen der morphologischen Variation über Organoide hinweg: Die Organoidgröße ist mit der IGF1-Rezeptorsignalisierung verbunden, und die zystische vs. solide Organoidarchitektur ist mit LGR5 + -Stammhaftigkeit verbunden.Die behandlungsinduzierte Organoid-Morphologie spiegelt die Organoid-Lebensfähigkeit und den Wirkmechanismus des Medikaments wider und ist biologisch interpretierbar.Die Hemmung von MEK führt zu einer zystischen Reorganisation von Organoiden und erhöht die Expression von LGR5, während die Hemmung von mTOR die IGF1-Rezeptorsignalisierung induziert.Zusammenfassend identifizieren wir gemeinsame Variationsachsen für die Organoidmorphologie von Darmkrebs, ihre zugrunde liegenden biologischen Mechanismen und pharmakologische Interventionen mit der Fähigkeit, Organoide entlang dieser zu bewegen.Darmkrebs ist weltweit die dritthäufigste Krebsart und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache1.Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung werden in der Regel mit Chemotherapie und Antikörpertherapien behandelt, bei der derzeitigen Behandlung können Tumore jedoch weiter fortschreiten und die Prognose bleibt schlecht2.Die Tumorplastizität sowie die Stammhaftigkeit neoplastischer Zellen wurden als Hauptfaktoren für Behandlungsresistenz und Tumorprogression unter antineoplastischen Therapien vorgeschlagen3,4.Die Mechanismen hinter diesen Tumorzellzuständen und Arzneimitteln, die sie modulieren oder angreifen, sind jedoch nicht gut verstanden.Von Patienten stammende Organoide sind von Stammzellen abgeleitete 3D-Tumormodelle, die effizient aus (Darm-)Krebs und normalem Gewebe erstellt werden können5,6,7.Die Isolierung von Organoiden aus menschlichen Primärtumoren und Metastasen5,8 hat die Einrichtung lebender Biobanken ermöglicht6,7,9.Insbesondere wurde gezeigt, dass von Patienten stammende Organoide die molekularen Merkmale und die Morphologie ihres Ursprungs darstellen6,7,8,10, was funktionelle Experimente wie Arzneimitteltests ex vivo ermöglicht7,9,11,12,13,14,15,16.Infolgedessen sind Organoide ein attraktives Modellsystem, da sie die Modellierungskapazität von Xenotransplantaten aus Patienten mit der Skalierbarkeit von adhärenten In-vitro-Zelllinien kombinieren.Bildbasiertes Profiling ist eine Hochdurchsatz-Mikroskopie-basierte Methode zur systematischen Messung von Phänotypen von In-vitro-Modellen.In Kombination mit chemischen oder genetischen Störungen ist die bildbasierte Profilerstellung ein leistungsstarker Ansatz, um systematische Einblicke in biologische Prozesse zu gewinnen, beispielsweise in der Wirkstoffforschung und der funktionellen Genomforschung17,18,19.Bildbasierte Assays wurden verwendet, um große Bibliotheken kleiner Moleküle zu screenen, um potenzielle Arzneimittelkandidaten zu identifizieren, die Wirkungsweise eines Arzneimittels zu analysieren oder Arzneimittel-Gen-Wechselwirkungen nach Zellmorphologie zu klassifizieren20,21,22,23.Die Durchführung großer bildbasierter Profilierungsexperimente von Organoiden war jedoch eine biologische, technische und rechnerische Herausforderung24,25,26.Infolgedessen sind die morphologische Heterogenität von Krebsorganoiden, die von Patienten stammen, zwischen und innerhalb von Patientenspendern, ihr abweichendes Verhalten bei pharmakologischen Störungen sowie die zugrunde liegenden Mechanismen der Morphologie von Krebsorganoiden noch nicht systematisch verstanden.Hier berichten wir über eine groß angelegte bildbasierte Phänotypisierungsstudie von von Patienten stammenden Krebsorganoiden, um die zugrunde liegenden Faktoren zu verstehen, die die Organoidmorphologie bestimmen.Darmkrebs-Organoide von 11 Patienten wurden mit mehr als 500 experimentell und klinisch verwendeten kleinen Molekülen in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt.Wir haben die morphologische Heterogenität von von Patienten stammenden Organoiden und ihre Reaktion auf zusammengesetzte Störungen anhand von mehr als 3.700.000 konfokalen Mikroskopiebildern systematisch kartiert.Wir fanden heraus, dass die resultierende Landschaft von organoiden Phänotypen hauptsächlich von Unterschieden in der Organoidgröße, der Lebensfähigkeit und der zystischen vs. soliden Organoidarchitektur bestimmt wurde.Mithilfe der Multi-Omics-Faktoranalyse zur Integration von Organoidmorphologie, Größe, Genexpression, somatischen Mutationen und Arzneimittelaktivität identifizierten wir biologische Programme, die diesen Phänotypen zugrunde liegen, und kleine Moleküle, die sie modulieren.Um die Vielfalt der organoiden Phänotypen, medikamenteninduzierten phänotypischen Veränderungen und die zugrunde liegenden Faktoren, die sie antreiben, besser zu verstehen, haben wir von Patienten stammende Organoide von 13 Darmkrebspatienten generiert, die unterschiedliche klinische Stadien und Genotypen repräsentieren (ergänzende Abb. S1a–d, ergänzende Tabellen 1 und 2).Wir haben ein bildbasiertes Profiling mit Einzelorganoidauflösung mit 11 Organoidlinien (Abb. 1a) unter Verwendung von kleinen Molekülen durchgeführt, die auf Entwicklungswege abzielen, Proteinkinasen (464 Verbindungen in einer einzigen Konzentration von 7,5 µM) sowie kleine Moleküle in klinischer Anwendung (63 Verbindungen in 5 Konzentrationen, ergänzende Abb. S2a–c).Nach drei Tagen Kultur und vier Tagen pharmakologischer Störung in 384-Well-Platten wurden Organoide anschließend mit fluoreszierenden Markern für Aktin (Phalloidin), DNA (DAPI) und Zellpermeabilität (DeadGreen) gefärbt, um ihre Morphologie mit konfokalem Hochdurchsatz zu erfassen Mikroskopie.Wir projizierten die 3D-Bilddaten auf eine 2D-Ebene, segmentierten Organoide und berechneten morphologische Profile für jedes Organoid, das 528 phänotypische Merkmale (wie Farbstoffintensität, Textur und Form) umfasste, die anschließend in 25 Hauptkomponenten reduziert wurden, die 81 % der morphologischen Varianz darstellen ( Ergänzende Abb. S2c).a Schematische Übersicht der Experimente: Organoide wurden aus endoskopischen Biopsien von Patienten mit Darmkrebs isoliert.Organoide wurden dissoziiert und gleichmäßig in Platten mit 384 Vertiefungen ausgesät, bevor sie mit einer experimentellen (464 Verbindungen) und einer klinischen Verbindungsbibliothek (63 Verbindungen mit jeweils 5 Konzentrationen, 842 Störungen über beide Bibliotheken) gestört wurden.Nach der Behandlung wurde Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Morphologie von Organoiden zu erfassen.Die Mehrkanal-3D-Bildgebungsdaten (DNA, Beta-Aktin, Zellpermeabilität) wurden projiziert, segmentiert und Phänotypmerkmale extrahiert, um potenzielle arzneimittelinduzierte Phänotypen zu quantifizieren.Unbehandelte Organoid-Morphologie, Organoid-Größe und Scores der Arzneimittelaktivität wurden mit mRNA-Expressions- und Mutationsdaten in einer Multi-Omics-Faktor-Analyse (MOFA) integriert.b Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) von Merkmalen auf Organoidebene für eine zufällige 5 %-Stichprobe aus etwa 5,5 Millionen Organoiden.Dieselbe Probe wird für Visualisierungen in der gesamten Figur verwendet.Die Farbe entspricht dem logarithmisch skalierten organoiden Bereich (dunkelblau: minimale Größe, gelb: maximale Größe).c Organoidgrößenverteilung über Organoidlinien hinweg.d UMAP-Darstellung von mit DMSO behandelten und mit Arzneimittel behandelten Organoiden.Graphbasiertes Clustering von Organoiden nach Morphologie mit 12 resultierenden Clustern.e UMAP-Einbettungen ausgewählter Organoidlinien (Ausgangszustand = 0,1 % DMSO-kontrollbehandelte Organoide), die unterschiedliche morphologische Untergruppen darstellen, grauer Hintergrund besteht aus zufällig ausgewählten Punkten.Dargestellt sind repräsentative Beispielbilder für jede Organoidlinie (rechts, Cyan = DNA, Magenta = Aktin, Maßstabsbalken: 200 µm).Um die Heterogenität von Darmkrebs-Organoiden und behandlungsinduzierte Veränderungen über und innerhalb von Organoidlinien zu visualisieren, haben wir Merkmale von etwa 5,5 Millionen profilierten Organoiden mit einheitlicher vielfältiger Approximation und Projektion eingebettet (UMAP, Abb. 1b, ergänzende Abb. S2d–f).Innerhalb der meisten Organoidlinien gab es eine charakteristische zweikomponentige log-normale Mischungsverteilung der Organoidgröße, wobei eine Komponente kleine Organoide und eine andere Komponente größere Organoide mit unterschiedlicher, organoidlinienspezifischer, reproduzierbarer Durchschnittsgröße enthielt (Abb. 1c, ergänzende Abb. S2g , h).Die Log-Normal-ähnliche Größenverteilung resultierte wahrscheinlich aus intrinsischen Unterschieden in der Zellgröße und Wachstumsrate, die sich im Verlauf des Experiments in mehrzelligen Organoiden ansammelten.Als Nächstes führten wir ein graphbasiertes Clustering an dieser Einbettung durch, um die Landschaft zu beschreiben, was zu 12 Clustern führte (Abb. 1d).Organoidlinien innerhalb der Einbettung befanden sich in charakteristischen Clustern mit Organoidgröße und Organoidarchitektur als primäre Organisationsfaktoren (Abb. 1e).Beispielsweise hatte die Organoidlinie D018T die größte mittlere Organoidgröße innerhalb des Datensatzes und eine zystische Organoidarchitektur mit einem einzigen zentralen Hohllumen und einer Monoschicht umgebender Zellen.Im Gegensatz dazu hatten D020T-Organoide eine solide Architektur und eine kleinere mittlere Größe.In den meisten Fällen hatten organoide Linien zwei Hauptdichtebereiche, von denen einer in den Clustern 2, 3 oder 4 lag, was die zuvor erwähnte bimodale Größenverteilung widerspiegelt.Beim Vergleich von mit Arzneimitteln behandelten Organoiden mit Basislinien-Organoiden, die mit der Lösungsmittelkontrolle (DMSO) behandelt wurden, war keine klare Trennung der Gruppen ersichtlich, was darauf hindeutet, dass die Organoidmorphologie auf einem Kontinuum von Phänotypen verteilt war, das gestörte und ungestörte Bedingungen unseres Experiments umfasste (ergänzende Abb. S2i ).Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die bildbasierte Profilierung von Organoiden aus Darmkrebs, die von Patienten stammen, eine starke morphologische Heterogenität mit spenderabhängigen Unterschieden in Größe und Organoidarchitektur zeigte.Arzneimittelinduzierte Veränderungen der Lebensfähigkeit von Zellen sind ein grundlegender Hinweis bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten.Angeregt durch die Beobachtung, dass die Organoidgröße ein wichtiger Faktor für die Einbettung des Phänotyps war, stellten wir die Hypothese auf, dass die kleine Organoidgröße, die bei allen Spendern beobachtet wurde, zumindest teilweise das Ergebnis des Zelltods innerhalb des Organoids und allgemeiner dieser Phänotypdaten war könnte verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von Organoiden abzuschätzen.Um diese Hypothese zu testen, wählten wir Bortezomib, einen niedermolekularen Proteasom-Inhibitor mit hoher In-vitro-Toxizität, sowie SN-38 (aktiver Metabolit von Irinotecan).Beide kleinen Moleküle führten in allen Organoidlinien zu einem dosisabhängigen Organoidtod (Abb. 2a).Analog zur Pseudozeit in der Einzelzell-Genexpressionsanalyse27 haben wir dosisabhängige Trajektorien von Bortezomib (Abb. 2b) und SN-38 (ergänzende Abb. S3a) angepasst.Ausgehend von unterschiedlichen Grundlinienmorphologien führten zunehmende Dosen dieser Verbindungen zu einer schrittweisen Konvergenz zu einem endgültigen todbezogenen Phänotyp, der den Bereichen mit Anreicherung kleiner Objekte entsprach (Cluster 2, 3 und 4 in Abb. 1d).In ähnlicher Weise verschob Paclitaxel, ein Inhibitor der Demontage von Mikrotubuli, die bimodale Größenverteilung von Organoiden dosisabhängig (ergänzende Abb. S3b), während die Anzahl der Organoide weitgehend unverändert blieb (ergänzende Abb. S3c).Dieser Effekt war jedoch organoidlinienspezifisch, da wir eine dosisabhängige Abnahme der mittleren Organoidgröße in Paclitaxel-„Responder“-Linien (z. B. D022T) beobachteten, während die Größe anderer Organoide unbeeinflusst blieb (z. B. D046T, Abb. 2c– f).Diese Beobachtungen legten einen Zusammenhang zwischen der organoiden Morphologie, insbesondere der organoiden Größe, mit einem Verlust der Zelllebensfähigkeit nahe.Um die Fähigkeit der organoiden Morphologie zur Vorhersage der Zelllebensfähigkeit zu testen, haben wir parallel zur Bildgebung einen lumineszenzbasierten, ATP-abhängigen Zelllebensfähigkeitsassay (CTG) als Benchmark für Medikamente in der klinischen Krebsbibliothek durchgeführt.Wir sahen einen starken Zusammenhang zwischen der CTG-Lebensfähigkeit und der Organoidgröße (Abb. 2g), was uns veranlasste zu testen, ob eine genauere Vorhersage der Organoidlebensfähigkeit möglich war, indem alle verfügbaren Bildgebungsdaten, einschließlich der Organoidgröße, verwendet wurden.Zu diesem Zweck haben wir zufällige Waldklassifikatoren (Live/Dead-Klassifikatoren, LDC) an individuellen Organoid-Phänotypprofilen trainiert, um zwischen negativen und positiven Kontrollbehandlungen (DMSO, Bortezomib und SN-38, ergänzende Abb. S3d, e) zu unterscheiden.Wir beobachteten eine robuste Klassifizierungsleistung, wenn sie auf Sätze derselben oder unsichtbaren Organoidlinien angewendet wurden (ergänzende Abb. S3f).Wenn der Klassifikator auf den gesamten Bilddatensatz angewendet und Vorhersagen über UMAP visualisiert wurden, hatten kleine Organoide in den zuvor identifizierten Clustern 2, 3 und 4 erwartungsgemäß die höchsten Todeswahrscheinlichkeiten (Abb. 2h).Die LDC-Vorhersagen hatten die höchste Korrelation mit CTG-basierten Lebensfähigkeitsdaten (Abb. 2i), jedoch war die Assoziation mit der Organoidgröße bei den meisten Organoidlinien fast so stark (Abb. 2i, ergänzende Abb. S3g), während andere einfache Merkmale , wie DNA (DAPI), Aktin (Phalloidin) und insbesondere die Intensität der Permeabilität (DeadGreen), isoliert, weniger geeignet, um die Lebensfähigkeit von Organoiden vorherzusagen (Abb. 2i).Wir haben auch in Ablationsexperimenten festgestellt, dass LDCs mit unvollständigem Zugriff auf Kanalinformationen (d. h. nur von DAPI und Phalloidin-Färbung abgeleitete Merkmale waren für Training und Schlussfolgerung verfügbar) in einigen Fällen fast so hohe Klassifizierungsgenauigkeiten zeigten wie Klassifikatoren mit Zugriff auf vollständige Daten (Supplementary Abb. S3h).Schließlich beobachteten wir Beispiele für divergierende Ergebnisse zwischen LDC-Vorhersagen und CTG-Auslesungen.Dazu gehörten (1) das Antifolat-Medikament Methotrexat und (2) ein Doxorubicin-induziertes Artefakt aufgrund der stark roten Farbe der Verbindung.Methotrexat zeigte in fast allen Organoidlinien in CTG-basierten Experimenten eine starke Toxizität, hatte jedoch basierend auf dem LDC keine sichtbare Auswirkung auf die Lebensfähigkeit von Organoiden (ergänzende Abb. S3i–l).Diese Diskrepanz kann durch nicht letale metabolische Wirkungen von Methotrexat erklärt werden.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass grundlegende Merkmale wie die mittlere Organoidgröße sowie die Klassifizierung von Textur- und Forminformationen aus grundlegenden DNA- und Aktinfärbungen die Lebensfähigkeit von Organoiden vorhersagen können.a Repräsentative Beispielbilder von mit Negativ- (0,1 % DMSO) und Positivkontrolle behandelten Organoiden (2,5 µM Bortezomib, Cyan = DNA, Magenta = Aktin, Gelb = Zellpermeabilität; repräsentative Bilder wurden ausgewählt und in schwarzen Hintergrund eingebettet; Maßstabsbalken: 50 µm) .b Dosisabhängiger Verlauf der Arzneimittelwirkung von Bortezomib.UMAP der Organoid-Morphologie bei verschiedenen Bortezomib-Dosen und (rechts) dosisabhängiger Verlauf für drei repräsentative Organoid-Linien.Während der Hauptkurvenanpassung schloss die Trajektorieninferenz Cluster 4 aus, eine Reihe von Messungen, die hauptsächlich tote organoide Partikel darstellen, die ca.5 % aller Bilddaten.c Dosis-Wirkungs-Beziehung von Organoidgröße und Paclitaxel-Dosis.D022T und D046T sind als Beispiele für Responder/Non-Responder-Leitungen hervorgehoben.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.d UMAP der Organoidmorphologie, die D022T-Organoide hervorhebt, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Paclitaxel behandelt wurden.e D046T-Organoide, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Paclitaxel behandelt wurden.f Beispielbilder von mit Paclitaxel behandelten D022T-Organoiden.Cyan = DNA, Magenta = Aktin, repräsentative Bilder von Organoiden wurden ausgewählt und in schwarzen Hintergrund eingebettet;Maßstabsbalken: 50 µm).g Assoziation der Organoidgröße ausgewählter beispielhafter Organoidlinien mit der Lebensfähigkeit, bestimmt durch Lumineszenz-basiertes, ATP-abhängiges Lebensfähigkeitsprofiling mit CellTiter-Glo (CTG), das parallel zur Bildgebung an einer Teilmenge von Arzneimittelbehandlungen zum Benchmarking durchgeführt wurde.h UMAP-Visualisierung von Lebensfähigkeitsvorhersagen für Organoide in unserem Datensatz, basierend auf überwachtem maschinellem Lernen der Lebensfähigkeit von Organoiden unter Verwendung von Klassifikatoren, die an positiven (hochdosiertes Bortezomib und SN-38) und negativen (DMSO) Kontrollen (Live-Dead-Klassifikatoren, LDC) trainiert wurden.i Assoziation von LDC- und beispielhaften organoiden Merkmalen (Größe, DAPI, Aktin- und Permeabilitätsfarbstoffintensitäten) mit ausgelesener Benchmark-CTG-Lebensfähigkeit.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Ein Vorteil der bildbasierten Profilerstellung gegenüber Zellviabilitätsmessungen in der Arzneimittelforschung ist die Möglichkeit, die hochdimensionalen arzneimittelinduzierten Phänotypprofile zu verwenden, um aktive, aber nicht unbedingt tödliche kleine Moleküle zu identifizieren und ihren Wirkungsmechanismus durch ähnlichkeitsbasiertes Clustering abzuschätzen.Um zu testen, ob dieser Ansatz bei von Patienten stammenden Krebsorganoiden verwendet werden kann, haben wir einen überwachten Lernansatz für Medikamente in der KiStem-Bibliothek verwendet, um Wirkstoffwirkungsprofile zu identifizieren und sie nach Ähnlichkeit zu gruppieren.Zunächst haben wir logistische Regressionsmodelle trainiert, um einzelne mit Verbindungen behandelte Organoide von ungestörten Kontrollen zu unterscheiden, und den resultierenden Normalvektor zwischen Kontroll- und behandelten Organoid-Phänotypen als Arzneimittelwirkungsprofil definiert.Als nächstes bewerteten wir die Fähigkeit jedes logistischen Regressionsmodells, behandelte und unbehandelte Organoide zu trennen, um aktive Behandlungen zu identifizieren, die eine robuste Änderung der Organoidmorphologie induzieren (Fläche unter der Empfängerbetriebseigenschaft, AUROC, im Bereich von 0,5 bis 1).Wir betrachteten Behandlungen als aktiv, wenn die Leistung ihrer Klassifikatoren einen AUROC-Wert von 0,85 überstieg (Abb. 3a, b).Basierend auf unseren Beobachtungen war die Arzneimittelaktivität für einen Lebensfähigkeitseffekt notwendig, aber nicht ausreichend (Abb. 3c), da ein Bruchteil der Arzneimittel zu identifizierbaren Veränderungen in der organoiden Morphologie führte (sie wurden als aktive Arzneimittel betrachtet), aber von unserem Leben nicht als tödlich eingestuft wurden. Dead Classifier (LDC)-Modelle.ein Histogramm der durchschnittlichen Modellleistung für jedes getestete Medikament.Für jede getestete Arzneimittel- und Organoidlinie wurden logistische Regressionsmodelle trainiert, um mit Negativkontrolle behandelte Organoide von mit Arzneimittel behandelten Organoiden zu unterscheiden.Ein Medikament wurde als „aktiv“ betrachtet, wenn es einen Phänotyp induzierte, der von DMSO-Kontrollphänotypen mit einer mittleren Klassifikationsleistung von > 0,85 Fläche unter der Receiver Operating Characteristic Curve (AUROC) getrennt werden konnte.b Anzahl aktiver Arzneimittel pro Organoidlinie.c Beziehung zwischen arzneimittelinduzierter Veränderung der Lebensfähigkeit (vorhergesagt durch LDC, vergleiche Fig. 2) und allgemeiner Verbindungsaktivität.d Unüberwachtes Clustering von Arzneimittelwirkungsprofilen für aktive Arzneimittel.Der Abstand zwischen Arzneimittelwirkungsprofilen wurde unter Verwendung von Kosinusähnlichkeit berechnet.Arzneimittelwirkungsprofile wurden durch Anpassen logistischer Regressionsmodelle zwischen behandelten und unbehandelten Organoiden für jedes Arzneimittel und jede Linie bestimmt.Als Eingabemerkmale wurden PCA-transformierte Morphologieinformationen verwendet.Der exakte Fisher-Test wurde verwendet, um Anreicherungen von Arzneimitteln zu identifizieren, die mit demselben Arzneimittelziel innerhalb der hierarchischen Gruppierung annotiert sind.Getestete Cluster hatten eine minimale Clustergröße von 3 und wurden iterativ von unten nach oben bewertet.Die Farben an der Seite der Heatmap stellen die Wirkmechanismen von Arzneimitteln dar.e–h Zoom-Ins von (d) mit Clustern, die für MEK (e), PI3K/mTOR (f), EGFR (g) und GSK-3 (h) angereichert sind.i Lebensfähigkeit von arzneimittelinduzierten Phänotypen in einzelnen Organoidlinien, bestimmt durch überwachtes maschinelles Lernen.Die Arzneistoffe wurden auf der x-Achse in der gleichen Reihenfolge wie in (d) angeordnet.j Organoide, die für ausgewählte arzneimittelinduzierte Phänotypen repräsentativ sind.Bilder der Organoidlinien D004T und D030T wurden für jeden Organoid-Phänotyp ausgewählt, automatisch zugeschnitten und in einen schwarzen Hintergrund eingebettet.Cyan = DNA, Magenta = Aktin;Maßstabsbalken: 50 µm.Um zu testen, ob aktive Medikamente systematisch organoide Phänotypen induzierten, die für den Wirkmechanismus informativ waren, bewerteten wir die Ähnlichkeit mit zwei verschiedenen Methoden, (1) dem Kosinusabstand zwischen verketteten Arzneimittelwirkungsprofilen und (2) dem euklidischen Abstand von gemittelten behandlungsinduzierten Phänotypen ( Abb. 3d–h, ergänzende Abb. S4a–c, S5a–c).Obwohl beide Methoden in Bezug auf ihre Fähigkeit, Arzneimittel nach Wirkungsmechanismus zu gruppieren, ähnlich waren, fuhren wir mit der Cosinus-Distanz-Clusterung fort, da Arzneimittelwirkungsprofile nicht nur die Richtung der Phänotypänderung erfassten, sondern auch mit AUROC als Metrik des Arzneimittels verknüpft waren Aktivität, die zwischen 0,5 und 1 skaliert wurde. Wir beobachteten eine Häufung von Medikamenten nach ihrer spezifischen Wirkungsweise, einschließlich Inhibitoren von MEK, Aurora-Kinase, CDK, mTOR, AKT, EGFR oder GSK3 (Abb. 3d).Kleine Moleküle mit Zielen innerhalb desselben Signalwegs induzierten auch verwandte Morphologien, zum Beispiel waren MEK-Inhibitoren, die mit spezifischen RAF- und ERK-Inhibitoren geclustert waren (Abb. 3e), und AKT/PI3K-Inhibitoren Teil eines Clusters, das hauptsächlich mTOR enthielt, das auf kleine Moleküle abzielte (Teil von Der Cluster ist in Abb. 3f, der gesamte Cluster in der ergänzenden Abb. S5a) dargestellt.Die Clusterbildung deutete auch auf zusätzliche Wirkungsweisen oder Off-Target-Effekte für gut beschriebene kleine Moleküle hin (Abb. 3g–h).Beispielsweise wurde der PKC-Inhibitor Enzastaurin mit GSK3-Inhibitoren geclustert, was eine zuvor beschriebene Wechselwirkung von Enzastaurin mit den Alpha- und Beta-Untereinheiten von GSK328,29 bestätigt (Abb. 3h).Bemerkenswerterweise waren mehrere arzneimittelinduzierte Phänotypen bei den meisten oder allen getesteten Organoidlinien beobachtbar, aber die Mehrheit der Verbindungsklassen führte zu einer signifikanten Anreicherung der Wirkstoffprofil-Vektorcluster nur in Teilmengen oder einzelnen Organoidlinien (ergänzende Abb. S5d).Um zu beurteilen, ob morphologische Profile aktiver medikamentöser Behandlungen hauptsächlich von Unterschieden in der Lebensfähigkeit von Organoiden bestimmt wurden, verglichen wir LDC-Vorhersagen mit der phänotypischen Clusterbildung (Abb. 3i).Wir beobachteten eine größere Gruppe von tödlichen Behandlungen (einschließlich Molekülen, die auf ATM, JAK, PLK, CDK abzielen).Die Mehrheit der Cluster wurde jedoch durch nicht tödliche Phänotypen verursacht, einschließlich solcher, die durch Inhibitoren von AKT, mTOR, EGFR oder GSK3 induziert wurden.Die visuelle Untersuchung mehrerer Phänotypen (Fig. 3j) zeigte wiederkehrende Arzneimittel-Target-abhängige Morphologien.Vor allem führten MEK-Inhibitoren zu einer Reorganisation hin zu einer stärker zystischen organoiden Architektur.Insgesamt erfassten arzneimittelinduzierte Phänotypen die Wirkungsweise von Arzneimitteln und waren in den meisten getesteten Organoidlinien sichtbar.Eine Einschränkung bildbasierter Profiling-Experimente besteht darin, dass sowohl ungestörte als auch medikamenteninduzierte Morphologien hinsichtlich ihrer zugrunde liegenden Biologie schwierig zu interpretieren sind.Theoretisch können in Gegenwart mehrerer In-vitro-Modelle mit Phänotyp- und Genommessungen Verbindungen zwischen den beiden Datenmodalitäten erlernt werden.Basierend auf der Beobachtung, dass die organoide Morphologie in einem kontinuierlichen Raum verteilt war, stellten wir die Hypothese auf, dass Variationen in der organoiden Ausgangsmorphologie mit Unterschieden in der Genexpression, Mutationen sowie der Arzneimittelaktivität für die 11 organoiden Krebslinien in unserer Probe (2 biologische jede Wiederholung, insgesamt 22 Beobachtungen).Um die gemeinsame Verteilung von ungestörter organoider Morphologie, ungestörter organoider Größe, Genexpression, ausgewählten somatischen Mutationen und Arzneimittelaktivität zu faktorisieren, führten wir eine Multi-Omics-Faktor-Analyse (MOFA)30 durch.MOFA ist eine Matrixfaktorisierungsmethode, die eine Reihe verschiedener Messungen in eine gemeinsame Tabelle von Faktoren zerlegt, die jede beobachtete Stichprobe bewertet, und eine Reihe von entsprechenden Ladetabellen, die jeden Faktor mit Merkmalen in der Reihe von ursprünglichen Messungen verknüpfen30.Beim Training mit k = 3 Faktoren erholte sich MOFA von Faktoren, die ungefähr 24–41% der Varianz über die verschiedenen Datenmodalitäten hinweg erklärten (Abb. 4a, b, ergänzende Abb. S6a – c).Während Genexpression, Mutationen und Arzneimittelaktivitätsprofile für Organoidlinien zu allen Faktoren beitrugen, erfasste Faktor 1 die meisten Variationen in der mittleren Organoidgröße (ca. 39 %).Im Gegensatz dazu erfasste Faktor 2 hauptsächlich die Variation innerhalb der unbehandelten organoiden Morphologie (ca. 16 %) (Abb. 4a).Die organoiden Linien D046T und D004T stachen als Linien mit der stärksten Punktzahl für Faktor 1 heraus, während die organoiden Linien D018T und D013T die stärkste Punktzahl bei Faktor 2 aufwiesen (Abb. 4c).Organoide mit hohen Faktorwerten befanden sich in charakteristischen Regionen der zuvor definierten UMAP-Einbettung (ergänzende Abb. S6d).Die visuelle Untersuchung von Organoiden ergab, dass Organoidlinien mit einem höheren Faktor-1-Score tendenziell größer waren und Organoide mit einem hohen Faktor-2-Score basierend auf der manuellen Klassifizierung tendenziell eine zystischere Organoidarchitektur aufwiesen.Allein die Analyse der Genexpressionsdaten ergab Muster analog zu Faktor 1 und Faktor 2 (ergänzende Abb. S6e, f).Wir konnten keine interpretierbaren morphologischen Unterschiede zwischen Organoiden mit niedrigem und hohem Faktor 3 identifizieren und konzentrierten unsere nachfolgende Analyse auf die ersten beiden interpretierbaren Faktoren, die von MOFA erzeugt wurden.Zusammenfassend identifizierte das MOFA Faktoren innerhalb des Datensatzes, die die Variation zwischen Organoidlinien über verschiedene Datenmodalitäten hinweg erklärten, einschließlich der Organoidmorphologie und der mittleren Größe.a, b Varianzzerlegung des MOFA-Modells.Unbehandelte Organoid-Morphologie, Organoid-Größe und Scores der Arzneimittelaktivität wurden mit DNA-Sequenzierungs- und mRNA-Expressionsdaten integriert.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.a Prozentsatz der Varianz, die durch jeden Faktor in jeder Datenmodalität erklärt wird.b Kumulativer Anteil der Gesamtvarianz, der durch jede experimentelle Datenmodalität innerhalb des MOFA-Modells erklärt wird.c Visualisierung von Proben im Faktorraum mit den Faktoren 1 und 2. Dargestellt sind zwei unabhängige Wiederholungen für jede Organoidlinie.Die organoide Morphologie (zystisch vs. fest), bestimmt durch visuelle Untersuchung von DMSO-Phänotypen, und die organoide Größe (logarithmisch skalierter organoider Bereich) werden jeweils durch Symbolform und -farbe dargestellt.Ein besonders stark wiederkehrender Organoid-Phänotyp war das Vorhandensein einer zystischen Organoid-Architektur, die bei unbehandelten D018T- oder D013T-Organoiden und mit MEK-Inhibitoren behandelten Organoiden zu sehen war (Abb. 1e, 3f und 5a).MOFA zeigte, dass Faktor 2 diesen zystischen organoiden Zustand darstellt.Im zystischen Zustand bestanden Organoide aus einer Monoschicht einheitlicher Zellen, die ein zentrales kugelförmiges Lumen mit einem ausgeprägten Aktin-Zytoskelett auskleideten (Abb. 5b).Wir betrachteten diesen Phänotyp als verwandt mit organoiden Morphologien, die zuvor in gentechnisch hergestellten APC-/- oder Wnt-Liganden behandelten intestinalen Organoiden beschrieben wurden31,32,33.Um zu testen, ob Faktor 2 tatsächlich die Wnt-Signalübertragung und Genexpressionsprogramme im Zusammenhang mit der Darmstammzellidentität erfasste, führten wir Genset-Anreicherungsanalysen (GSEA) für Zellidentitätssignaturen durch, die zuvor in Darmkrypten und Darmkrebs identifiziert wurden34.GSEA zeigte neben anderen biologischen Prozessen eine Anreicherung von Lgr5 + -Stammzellsignatur-bezogenen Genen für die Faktor-2-Beladungen (Abb. 5c) (FDR = 0,002, NES = 1,74) (ergänzende Abb. S7a).In Bezug auf genetische Mutationen hatte der ERBB2-Mutationsstatus den stärksten positiven Beitrag zur Faktor-2-Beladung (ergänzende Abb. 6c).a UMAP-Visualisierung der zystischen und soliden organoiden Morphologie im Ausgangszustand (DMSO-behandelt), wie durch Faktor-2-Scores definiert.b Beispielbilder von zystischen (rechts) und durchgezogenen organoiden Linien.Bilder wurden automatisch zugeschnitten und in einen schwarzen Hintergrund eingebettet.Cyan = DNA, Magenta = Aktin;Maßstabsbalken: 50 µm.c Genset-Anreicherungsanalyse der LGR5+-Darmstammzellensignatur34 über nach Rang geordneten Faktor-2-Genexpressionsladungen (Rangfolge von hoher Faktor-2-Ladung zu niedriger Faktor-2-Ladung), NES = normalisierter Anreicherungswert, Statistiken wurden mit GSEA unter Verwendung von 100.000 Permutationen berechnet).d Verteilungen der Wirkstoffaktivitätsladungen für Faktor 2, gruppiert nach Wirkstoffzielen.e Beziehung zwischen der Aktivität repräsentativer Arzneimittel und dem Faktor-2-Score.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Weitere Beispiele finden sich in Abb. S7.f Projektion von Faktor-2-Scores für arzneimittelinduzierte Phänotypen.Hervorgehoben sind Arzneimittelziele, die zu einer signifikanten Änderung der prognostizierten Faktorwerte über alle Organoidlinien (ANOVA) führen.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.g Prognostizierte dosisabhängige Änderungen der Faktor-2-Scores nach Behandlung mit dem MEK-Inhibitor Binimetinib über alle Organoidlinien hinweg.Die schwarze Linie zeigt die mittleren Faktor-2-Werte von 2 Wiederholungen von N = 11 Organoiden, die mit Binimetinib behandelt wurden, die graue Schattierung zeigt die 95 %-Konfidenzintervalle basierend auf der Löss-Regression mit Standardparametern94.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.h Dosisabhängige Veränderungen der organoiden Morphologie nach Behandlung mit dem MEK-Inhibitor Trametinib.Gezeigt sind Bilder der organoiden Linien D019T und D027T (Cyan = DNA, Magenta = Aktin; abgetastete Bilder wurden zugeschnitten und in schwarzen Hintergrund eingebettet; Maßstabsbalken: 50 µm) (i), Dosisabhängige Änderungen der LGR5-Transkripthäufigkeit nach Behandlung mit der MEK-Inhibitor Trametinib, bewertet durch qPCR, Daten von 3 (D027T) und 4 (D019T) unabhängigen Replikaten werden als Mittelwert + Standardabweichung *p < 0,05, **p < 0,005, NS = nicht signifikant, zweiseitiger Student-t-Test dargestellt .p-Werte: D019T: p = 0,061 (0,004 µM), p = 0,0196, (0,02 µM), p = 0,0187 (0,1 µM), p = 0,024 (0,5 µM), P = 0,0024 (2,5 µM), D027T: p = 0,0051 (0,004 µM), p = 0,00038, (0,02 µM), p = 0,045 (0,1 µM), p = 0,048 (0,5 µM), P = 0,090 (2,5 µM).Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Als nächstes fragten wir, ob Faktor 2 mit bestimmten Mustern der Drogenaktivität oder -inaktivität assoziiert ist.Wie zuvor beschrieben, haben wir die Leistung eines logistischen Regressionsmodells als Drug Activity Score (AUROC) verwendet (Abb. 3a).Die Aktivität von Wnt-Signalisierungsinhibitoren und EGFR-Inhibitoren trug im Durchschnitt am stärksten zu einem positiven Faktor-2-Score bei (t-Statistik = 3,02, FDR = 0,046 bzw. t-Statistik = 3,08, FDR = 0,046), während die Aktivität von ERK- und MEK-Inhibitoren assoziiert war mit einem niedrigen Faktor-2-Score (Abb. 5d), wenn auch nicht signifikant.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Organoidlinien mit hohem Faktor 2 eine erhöhte Expression von LGR5 zeigten und empfindlicher gegenüber Wnt-Signalisierungsinhibitoren waren, wie dem CBP / Beta-Catenin-Inhibitor PRI-724 (Abb. 5e und ergänzende Abb. S7b), was insgesamt auf eine erhöhte Abhängigkeit hindeutet Wnt-Signalisierung im Faktor-2-hohen organoiden Zustand.Angeregt durch die visuelle Beobachtung, dass die Behandlung mit MEK-Inhibitoren zu einer verwandten zystischen Architektur in Organoiden führte (Abb. 3j), stellten wir die Hypothese auf, dass Behandlungen mit Verbindungen die Plastizität zwischen den beobachteten organoiden Zuständen beeinflussen könnten.Daher haben wir getestet, ob medikamentöse Behandlungen organoide Phänotypprofile im zuvor definierten Faktorraum verschoben haben.Um auf Verschiebungen im Faktorraum zu testen, verwendeten wir als Ausgangspunkt die zuvor geschätzte Faktorladungsmatrix für ungestörte organoide Morphologie, die während des MOFA-Trainings generiert wurde.Indem wir die durchschnittlichen phänotypischen Profile von medikamentenbehandelten Organoiden auf die von MOFA gelernten Faktoren projizierten, konnten wir den Einfluss verschiedener medikamentöser Behandlungen auf biologische Programme annähern, die zuvor in ungestörten Organoiden identifiziert wurden.Wir beobachteten, dass MEK und fokale Adhäsionskinase-Inhibitoren die getesteten Organoidlinien signifikant in Richtung höherer Faktor-2-Scores verschoben (Abb. 5f und ergänzende Abb. S7c).Diese Änderung der Faktor-2-Scores war für MEK-Inhibitoren konzentrationsabhängig (Abb. 5g und ergänzende Abb. S7d, e) und entsprach einer visuellen Verschiebung der organoiden Morphologie (Abb. 5h), die am deutlichsten bei Konzentrationen von 100 nM (p = 0,017, Abb. 5h, ergänzende Abb. S7e).Angesichts der Beobachtung, dass Faktor 2 für eine LGR5 + -Stammzellsignatur angereichert war (Abb. 5c), haben wir die Expression von LGR5-Transkripten bei unterschiedlichen Konzentrationen der MEK-Inhibitorbehandlung für zwei Organoidlinien mit repräsentativen Faktorwerten (D019T und D027T) gemessen.Wir beobachteten analoge dosisabhängige Zunahmen der Transkripthäufigkeit (Abb. 5i).Diese Ergebnisse stimmten mit der Beobachtung überein, dass die MEK-Inhibitoraktivität einen negativen Beitrag zu Faktor 2 hatte (Abb. 5d): Während Organoide durch die MEK-Hemmung in einen Faktor-2-hohen Zustand versetzt werden, sind Organoide innerhalb des Faktor-2-hohen Zustands selbst relativ unempfindlich gegenüber dieser Klasse von Inhibitoren.Zusammenfassend beobachteten wir einen organoiden Zustand mit zystischer Architektur, eine erhöhte Expression von LGR5 + Stammzell-verwandten Genen und eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Wnt-Signalweg-Inhibitoren, die durch MEK-Hemmung induziert werden könnten.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarProz.Wissenschaft.Nat.Nat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.Nat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarWissenschaft.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.PubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.Nat.PubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarPubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.PubMed PubMed Central Artikel CAS Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarProz.Wissenschaft.CAS PubMed-Artikel Google ScholarWissenschaft.Stat.Nat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google Scholar